|
|
Úloha fosforylace proteinů v progamické fázi vývoje samčího gametofytu tabáku
Fíla, Jan ; Honys, David (vedoucí práce) ; Paleček, Jan (oponent) ; Smýkal, Petr (oponent)
Zralý pyl tabáku obsahuje silně dehydratovanou cytoplazmu a je metabolicky neaktivní. Po rehydrataci cytoplazmy je jeho metabolizmus nastartován a po dokončení aktivace vyrůstá pylovou aperturou pylová láčka. Změny v zavodnění cytoplazmy spolu s nastartováním metabolizmu jsou doprovázeny regulací translace i post-translačních modifikací (zejména fosforylace) přítomných proteinů. V této disertační práci jsou prezentovány fosfopeptidy ze zralého pylu tabáku virginského (Nicotiana tabacum), pylu aktivovaného in vitro 5 min a pylu aktivovaného in vitro 30 min. Z každého stádia byl získán celkový proteinový extrakt, jenž byl naštěpen trypsinem a získaná peptidová směs byla obohacena metodou MOAC (afinitní chromatografie s využitím kovového oxidu/hydroxidu) s matricí z oxidu titaničitého. Fosfopeptidy v obohaceném eluátu byly identifikovány kapalinovou chromatografií v kombinaci s tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC-MS/MS). Celkem bylo identifikováno 471 fosfopeptidů, nesoucích 432 přesně lokalizovaných fosforylačních míst. Získané fosfopeptidy pocházely z 301 fosfoproteinů, které spadaly do třinácti funkčních kategorií. Převládajícími funkcemi se staly transkripce, syntéza proteinů, cílení a skladování proteinů a přenos signálu. Mnohé fosfopeptidy podléhaly koncentračním změnám mezi třemi...
|
|
|
New molecular mechanisms involved in cell cycle control
Aquino, Cecilia ; Macůrek, Libor (vedoucí práce) ; Anger, Martin (oponent) ; Braun, Marcus (oponent)
Cecilia Aquino Perez, M. Sc. Abstrakt doktorské disertační práce V této doktorské práci jsme se zaměřili na nalezení a pochopení nových mechanismů řídících buněčný cyklus v normálních podmínkách i v kontextu buněčné odpovědi na různé formy stresu. Nejdříve jsme se zaměřili na studium Polo-like kinázy 3, která byla již dříve popsána v aktivaci kontrolních bodů cyklu v důsledku poškození DNA. Pomocí technologie CRISPR/Cas9 jsme cíleně inaktivovali gen PLK3 v lidských RPE buňkách a paralelně rovněž potlačili expresi PLK3 pomocí RNA interference. Hlavním pozorováním bylo zjištění, že PLK3 není nezbytná pro kontrolu buněčné odpovědi na poškození DNA, hypoxii a osmotický stres. Metodou hmotnostní spektrometrie jsme identifikovali fosfatázu PP6 a její regulační podjednotky PPP6R1 a PPP6R3 jako nové interakční partnery PLK3. Dále jsme pozorovali, že PLK3 je fosforylována na konzervovaném zbytku Thr219 a že deplece PP6 zvyšuje úroveň fosforylace PLK3 ovšem bez vlivu na její enzymatickou aktivitu. Tyto výsledky naznačují možnou regulaci funkce PLK3 prostřednictvím PP6 a biologická relevance tohoto pozorování bude předmětem dalšího studia. Dále jsme provedli transkriptomovou analýzu v lidských RPE-FUCCI buňkách s cílem nalézt potencionální nové regulátory buněčného cyklu. V dalším studiu jsme se zaměřili na Family...
|
|
|
Příprava a charakterizace katalytické domény lidské proteinkinasy ASK1.
Petrvalská, Olívia ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Proteinkinasa ASK1 (z angl. apoptosis signal-regulating kinase 1) patří do rodiny mitogeny aktivovaných proteinkinas kinas kinas (tzv. MAP3K) a hraje důležitou roli v imunitních a stresových odpovědích. Vzhledem k souvislosti mezi její zvýšenou aktivitou a rozvojem nemocí jako např. rakovina, kardiovaskulární a neurodegenerativní onemocnění, je tato bílkovina perspektivní cíl pro vývoj léčiv. Celý enzym se skládá z 1374 aminokyselinových zbytků (lidská ASK1), ale katalyticky aktivní je pouze Ser/Thr kinasová doména nacházející se přibližně uprostřed molekuly. Aktivita ASK1 je regulována prostřednictvím interakcí s různými proteiny včetně proteinu 14-3-3. Tento protein se váže na fosforylovaný serinový zbytek ASK1 v pozici 966 na C-konci katalytické domény. Tato vazebná interakce má za následek inhibici ASK1 prostřednictvím zatím neznámého mechanismu. Při stresovém signálu, nejčastěji při oxidativním stresu, se ASK1 na Ser966 defosforyluje a protein 14-3-3 disociuje. Rozpad komplexu ASK1:14-3-3 je jedním z dějů, které vedou k aktivaci ASK1. Cílem této práce byla příprava komplexu katalytické domény ASK1 s proteinem 14-3-3 pro následné studium interakcí těchto dvou proteinů. Oba proteiny byly úspěšně exprimovány v buňkách E. coli a purifikovány. Dále byly připraveny i různé mutantní formy obou těchto...
|
|
|
Studium interakcí ASK1 kinasy s thioredoxinem.
Koláčková, Kateřina ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Vaněk, Ondřej (oponent)
MAP kinasová signalizační kaskáda hraje důležitou roli při vzniku buněčných odpovědí na různé stresové podněty z vnějšího prostředí. Tato signalizační kaskáda je třístupňová: MAP kinasy kinasy kinasy (MAP3K) fosforylací aktivují MAP kinasy kinasy (MAP2K) a ty následně fosforylují a tím aktivují MAP kinasy (MAPK), čímž regulují spoustu buněčných funkcí jako je apoptosa, buněčné dělení či morfogenese. Jednou z důležitých MAP3K je proteinkinasa ASK1 (z angl. apoptosis signal-regulating kinase 1), která je důležitým regulátorem imunitních a stresových buněčných odpovědí. Vzhledem k tomu, že zvýšená aktivita ASK1 souvisí s rozvojem závažných onemocnění, jako jsou např. rakovina, kardiovaskulární a neurodegenerativní onemocnění, je ASK1 zajímavým cílem ve farmacii při vývoji nových léčiv. Lidská ASK1 sestává z 1374 aminokyselin a dělí se na tři domény: centrální Ser/Thr katalytickou doménu a dvě coiled-coil domény, z nichž první se nachází na N- a druhá na C-konci molekuly této proteinkinasy. ASK1 je regulována pomocí svých vazebných partnerů, mezi které patří také malý celulární redoxní protein thioredoxin (Trx-1), který se váže na N-terminální část ASK1. Trx-1 je silným antioxidantem a chrání tak buňky před toxickými podněty z okolí. Mechanismus regulace aktivity ASK1 pomocí Trx-1 je jedním z nejvíce...
|
|
|
In search of DUSP specificity
Sladeček, Stanislava ; Novotný, Marian (vedoucí práce) ; Martínková, Natália (oponent)
Duálně specifické fosfatázy (DUSP) jsou enzymy, které defosforylují fosfoserinové/threoninové a fosfotryrozínové zbytky na jednom substrátu. Většina z nich specificky defosforyluje rodinu mitogeny-aktivovaných protein kináz (MAPK). Počet DUSPů se zvyšuje u složitějších organismů a v lidském genomu je 25 popsaných DUSPů. Některé DUSPy mohou defosforylovat pouze jeden protein, zatímco jiné interagují s širším spektrem substrátů. S výjimkou substrátové specificity se DUSPy liší v expresii, subcelulární lokalizaci atd. Přestože byly první DUSPy popsány asi před 20 lety, doposud není popsaný žádný zřejmý faktor zodpovědný za jejich substrátovou specifitu. Předložená diplomová práce se snaží použitím in silico metod objasnit a popsat společné vlastnosti a rozdíly DUSPů, které mohou být důležité pro určování jejich specificity. Klíčová slova: fosfatázy, kinázy, DUSP, MAPK, substrátová specificita, konzervovanost aminokyselinových zbytků, fylogenetický strom, in silico metody
|
|
|
Úloha fosforylace proteinů v progamické fázi vývoje samčího gametofytu tabáku
Fíla, Jan
Zralý pyl tabáku obsahuje silně dehydratovanou cytoplazmu a je metabolicky neaktivní. Po rehydrataci cytoplazmy je jeho metabolizmus nastartován a po dokončení aktivace vyrůstá pylovou aperturou pylová láčka. Změny v zavodnění cytoplazmy spolu s nastartováním metabolizmu jsou doprovázeny regulací translace i post-translačních modifikací (zejména fosforylace) přítomných proteinů. V této disertační práci jsou prezentovány fosfopeptidy ze zralého pylu tabáku virginského (Nicotiana tabacum), pylu aktivovaného in vitro 5 min a pylu aktivovaného in vitro 30 min. Z každého stádia byl získán celkový proteinový extrakt, jenž byl naštěpen trypsinem a získaná peptidová směs byla obohacena metodou MOAC (afinitní chromatografie s využitím kovového oxidu/hydroxidu) s matricí z oxidu titaničitého. Fosfopeptidy v obohaceném eluátu byly identifikovány kapalinovou chromatografií v kombinaci s tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC-MS/MS). Celkem bylo identifikováno 471 fosfopeptidů, nesoucích 432 přesně lokalizovaných fosforylačních míst. Získané fosfopeptidy pocházely z 301 fosfoproteinů, které spadaly do třinácti funkčních kategorií. Převládajícími funkcemi se staly transkripce, syntéza proteinů, cílení a skladování proteinů a přenos signálu. Mnohé fosfopeptidy podléhaly koncentračním změnám mezi třemi...
|
|
|
The Role of Lck Kinase in T-cell Antigen Receptor Signaling
Němec, Dušan ; Štěpánek, Ondřej (vedoucí práce) ; Rösel, Daniel (oponent)
Aktivita LCK kinázy je nezbytně nutná pro zahájení procesu aktivace T lymfocytu. Primární funkcí LCK je převod informace o vazbě pMHC glykoproteinů na TCR do vnitřního prostředí buňky. Výsledkem kaskády, jež aktivní LCK spouští, je aktivace T buňky, produkce cytokinů, diferenciace a klonální expanze. Tato práce poskytuje souhrn současných znalostí o LCK kináze a její nenahraditelné roli v TCR signalizaci a stejně tak přehled nejvýznamnějších regulátorů a interakčních molekul. Dále pak popisuje význam interakce LCK s koreceptory pro optimální TCR signalizaci a fyziologický vývoj thymocytů a též zmiňuje diskutovanou roli LCK jako adaptorového proteinu T buněk. Klíčová slova: LCK, T lymfocyt, antigen, kináza, enzym
|
|
|
Counterbalances: antagonistic regulation of fission yeast growth and proliferation under favourable conditions and stress
Hohoš, Patrik ; Převorovský, Martin (vedoucí práce) ; Groušl, Tomáš (oponent)
Mikroorganizmy sa stretávajú s dramatickými zmenami podmienok prostredia. Je pre nich preto dôležité svižne a efektívne na tieto zmeny reagovať. Nevyhnutnými pre túto schopnosť sú signalizačné dráhy. Tie dokážu vnímať široké spektrum vonkajších i vnútorných stimulov a regulovať veľké množstvo bunkových procesov. Pre jednobunkové organizmy je jednou z najdôležitejších schopností vnímanie podmienok prostredia vhodných pre rast, alebo neobvyklých stresových podmienok. Jeden z obľúbených modelových mikroorganizmov používaných na výskum signalizačných dráh je kvasinka Schizosaccharomyces pombe. Výsledky získané výskumom na tomto modelovom organizme sú aplikovateľné aj na ďalšie eukaryotické organizmy, vďaka faktu, že signalizačné dráhy sú medzi kvasinkami a ostatnými eukaryotickými organizmami vysoko konzervované. Signalizačné dráhy podporujúce proliferáciu podporujú v kvasinke bunkovú proliferáciu, rast a mitotický bunkový cyklus. Stresové signalizačné dráhy majú opačnú úlohu. Podporujú bunkovú obranu proti stresovým stimulom. Taktiež podporujú proces sexuálnej diferenciácie a meitocký bunkový cyklus. Tento princíp môže na prvý pohľad vyzerať ako mechanizmus prepínača. Ukazuje sa, že v regulácii týchto dvoch signalizačných dráh je prítomný zložitý mechanizmus interakcií, ktoré a vzájomného...
|
|
|
Charakterizace vybraných vlastností modelových zástupců hemových senzorových proteinů
Fojtík, Lukáš ; Martínková, Markéta (vedoucí práce) ; Svášková, Dagmar (oponent)
Hemové senzorové proteiny představují čtvrtou skupinu hemoproteinů. V této skupině hemoproteinů slouží hem jako signální molekula. Disociace a asociace hemu u proteinů detekujících hem má vliv na regulaci fyziologických procesů např. regulace enzymové aktivity nebo genové exprese. V předkládané bakalářské práci jsou shrnuty dosavadní poznatky o vybraných zástupcích hlavně ze skupiny eukaryotických hemových senzorových proteinů publikované v odborných časopisech. V experimentální části této bakalářské práce jsme se zaměřili na přípravu rekombinantního proteinu, inhibitoru regulovaného hemem (HRI) a jeho proteinového substrátu, alfa podjednotky eukaryotického translačního iniciačního faktoru 2 (eIF2α). Nejprve byly připraveny, posléze amplifikovány a následně izolovány plasmidy nesoucí buď gen pro HRI nebo pro eIF2α. Následně byly dané proteiny připraveny heterologní expresí v bakteriálních buňkách E. coli BL-21(DE3) a celý proces zakončila jejich purifikace. Získali jsme finální preparát HRI o koncentraci 7,7 µM a celkovém objemu 400 µl a 60% homogenitě a finální preparát eIF2α o koncentraci 51,3 µM a celkovém objemu 400 µl a 80% homogenitě. Pilotní charakterizace obou získaných preparátů s ohledem na jejich teplotní stabilitu, přinesla důležité informace nezbytné pro správné uchovávání proteinů...
|
|
|
Úloha protein-proteinových interakcí v regulaci signálních proteinů a enzymů
Košek, Dalibor ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Karpenko, Vladimír (oponent) ; Pompach, Petr (oponent)
CZ Mezi všemi způsoby regulace signalizace mají protein-proteinové interakce přednostní postavení. Jejich studium v různých podmínkách je logickým a důležitým krokem v pochopení molekulárního mechanismu funkcí jednotlivých regulačních procesů. Tato práce je zaměřena na studium tří takových procesů: ASK1 proteinkinasa, důležitý iniciátor proapoptotických dějů, je za fyziologických podmínek udržována v neaktivním stavu v komplexu s proteinem 14-3-3 a TRX1. Za podmínek oxidačního stresu však tyto proteiny disociují a proteinkinasa se stává aktivní. Dalším procesem je interakce proteinu 14-3-3 s fosducinem a studium jeho úlohy v negativní regulaci G proteinové signalizace v rámci biochemie zraku. Třetí proces je aktivace Nth1 prostřednictvím interakce s Bmh1 a vápníkových kationů. Práce si klade za cíl pomocí různých biochemických a biofyzikálních metod, zejména bodové mutageneze, analytické ultracentrifugace, maloúhlového rozptylu rentgenového záření a fluorescenční spektroskopie přispět k objasnění strukturní podstaty výše popsaných dějů a vysvětlit úlohu protein-proteinových interakcí v jejich regulaci. Na základě výsledků získaných těmito metodami byly zjištěny strukturní informace o tvaru a stechiometrii komplexů TRX1 i proteinu 14-3-3 s odpovídajícími vazebnými doménami ASK1 včetně jejich...
|
host ::
RSS.